Study on the Mechanism of D-trehalose Enhancing the Killing of Escherichia coli by Aminoglycoside Antibiotics
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摘要:
寻找高效的抗生素佐剂并研究其增效杀菌机制是目前应对细菌耐药问题的有效策略之一。为探究D-海藻糖（D-trehalose）增强氨基糖苷类抗生素杀灭大肠杆菌的机制，以大肠杆菌BW25113为研究对象，测定D-trehalose联合氨基糖苷类抗生素作用前后的ATP、NADH含量以及质子动力势(PMF)，分析菌体内能量代谢和膜电位水平的变化，并通过抑菌圈实验检测对抗生素摄取的影响。结果提示：D-trehalose联合妥布霉素或庆大霉素双处理后，D-trehalose能够通过升高大肠杆菌PMF水平增加ATP合成，提高NADH水平，促进抗生素摄取，由此显著增强抗生素的杀菌效果。研究结果为开发D-海藻糖作为新型氨基糖苷类抗生素佐剂提供依据。
Abstract:Finding the efficient antibiotic adjuvants and studying their synergistic bactericidal mechanism is one of the effective strategies to deal with the problem of bacterial resistance. In order to explore the mechanism of D-trehalose enhancing the killing effect of Escherichia coli by the aminoglycoside antibiotics, by taking Escherichia coli BW25113 as the research object, the contents of ATP, NADH and proton motive force (PMF) were measured before and after the treatment of D-trehalose combined with the aminoglycoside antibiotics. The changes of energy metabolism and membrane potential in bacteria were analyzed, and the effect on the uptake of antibiotics was detected by using the inhibition zone experiment. The results showed that: after the double treatment with D-trehalose combined with tobramycin or gentamycin, D-trehalose could increase the synthesis of ATP, increase the level of NADH, and promote the uptake of antibiotics by increasing the PMF level of Escherichia coli, thus significantly enhancing the bactericidal effect of antibiotics. The results of this study provided a basis for the development of D-trehalose as a new-type aminoglycoside antibiotic adjuvant.
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Keywords:
- Escherichia coli /
- D-trehalose /
- Tobramycin /
- Gentamycin /
- Proton motive force
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自20世纪中叶首次发现抗生素可以作为饲料添加剂促进动物生长，畜牧养殖业开启了使用抗生素的时代[1]。随着抗生素在饲料及兽药领域等方面的不当使用以及滥用，抗生素耐药性的产业减弱了原有抗生素的功效，耐药细菌的出现使得感染性疾病的治疗变得困难[2]。研究人员便提出寻找一些抗生素佐剂以提高传统抗生素疗效，如通过增加细菌对药物摄取的方法来应对细菌耐药性[3]。本课题组前期通过外源添加D-海藻糖（D-trehalose）与三大类杀菌抗生素（氨基糖苷类抗生素、氟喹诺酮类抗生素及β-内酰胺类抗生素）对大肠杆菌BW25113和金黄色葡萄球菌ATCC25923进行杀灭测试[4]，结果发现其协同氨基糖苷类抗生素具有较好的杀菌效果，并且在不同的培养条件杀菌效果均显著，是一种潜在的有效抗生素佐剂[5]。因此，本研究进一步测试D-trehalose协同氨基糖苷类抗生素杀灭临床分离的耐药大肠杆菌的杀菌效果，评估其作为有效抗生素佐剂在临床治疗中的潜在应用价值。并且，为解析D-trehalose增效氨基糖苷类抗生素的杀菌机制，对菌体内能量代谢和膜电位变化情况，包括质子动力势（PMF）变化水平以及ATP、NADH含量进行测定，同时探究D-trehalose是否通过促进细菌胞内抗生素摄取增强杀菌效果。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
8株临床耐药大肠杆菌株来自福建医科大学附属第一医院，试验菌株为大肠杆菌BW25113。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 主要仪器
37℃恒温培养箱、光吸收全波长酶标仪、流式细胞仪、37℃恒温震荡培养器。
1.2.2 主要试剂
ATP检测试剂盒S0026、增强NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法)，3,3'-二乙基氧杂羰花青碘（DiOC2（3））、妥布霉素（Tobramycin，Tob）、庆大霉素（Gentamycin，Genta）、羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）。
1.3 试验方法
1.3.1 D-trehalose协同Tob杀灭临床耐药大肠杆菌的处理方法
使用LB液体培养基过夜活化8株临床耐药大肠杆菌，1∶500转接至新鲜LB中培养24 h。取9支试管，各加入500 μL菌液，编号1～9，1～3号试管为空白对照组（未处理）；4～6号试管加入终浓度为50 μg·mL−1 Tob（Tob单处理），7～9号试管加入终浓度为50 μg·mL−1 Tob以及30 mmol·L−1的D-trehalose（Tob+D-trehalose双处理），处理3 h后，取经不同试验条件处理的50 µL平台期的菌液用 PBS洗涤2遍后重悬。随后将菌悬液用PBS缓冲液依次进行10倍稀释，取4 µL稀释完的菌液滴于固体LB平板上。自然风干后于37℃培养箱中培养12 h，计算菌落数。8株临床耐药大肠杆菌具体耐药信息列于表1。
表 1 8株临床耐药大肠杆菌具体信息Table 1. Specific information of 8 clinical drug-resistant E. coli strains抗生素 菌株 210215789 210305622 210117294 210117528 210215749 210829790 210305607 210829776 氨苄西林 S R R R S R R R 哌拉西林 S I R ND S ND R ND 氨苄西林/舒巴坦 S R R S S S I S 哌拉西林/他唑巴坦 S S S S S S S S 头孢唑林 S R R R S R R R 头孢呋辛 S R S R S R R R 头孢他啶 S R R R S S R I 头孢曲松 S R R R S R R R 头孢吡肟 S S R R S S R R 头孢替坦 S R S ND S ND S ND 头孢呋辛酯 S R R ND S V R ND 氨曲南 S R R R S S R R 亚胺培南 S S S S S S S S 美罗培南 S S S S S S S S 阿米卡星 S S S S S S S S 庆大霉素 S S S ND S ND S ND 妥布霉素 R S S S S S S S 环丙沙星 I S S R S S S R 左旋氧氟沙星 S S I R S I S I 复方新诺明 I S S R S R S S 呋喃妥因 S S ND ND ND S ND 头孢哌酮舒巴坦 S ND S S S S ND S 阿莫西林克拉维酸 S I S S S S S S 替卡西林克拉维酸 S R ND S ND S S S 粘菌素 ND ND ND S ND S ND S 多西环素 ND ND ND R ND S ND R 米诺环素 ND ND ND I ND S ND S 替加环素 ND ND ND S ND S ND S 注：“S”代表敏感，“I”代表中介，“R”代表耐受，“ND”代表没有检测。 1.3.2 菌株活化、处理及洗涤方法
将存于−80℃的菌株大肠杆菌BW25113于37℃摇床培养过夜活化。以1∶500的比例接种于20 mL新鲜的液体培养基培养24 h达到平台期，所选用的氨基糖苷类抗生素为Tob、Genta。
取6根试管分别加入500 μL平台期大肠杆菌，1号管为空白对照组（未处理），2号管加入终浓度为30 mmol·L−1的D-trehalose（D-trehalose单处理），3号管加入终浓度为50 μg·mL−1 Tob（Tob单处理），4号管加入终浓度为50 μg·mL−1 Tob和30 mmol·L−1的D-trehalose（Tob+D-trehalose双处理），5号管加入终浓度为30 μg·mL−1 Genta（Genta单处理），6号管加入30 μg·mL−1 Genta和30 mmol·L−1的D-trehalose（Genta+D-trehalose双处理）。分别处理1.5 h后，用PBS洗涤2遍离心去上清后重悬。
（1）大肠杆菌胞内质子动力势水平测定 按照1.3.2的方法制作平台期大肠杆菌不同处理下的菌液，取100 μL处理后的菌液加1 mL PBS，加入终浓度为30 μmol·L−1的荧光染料DiOC2（3），37℃下孵育30 min后，流式细胞仪进行分析。DiOC2（3）探针会在细菌体内发生绿色荧光，膜电位的升高使得探针分子发生自聚，其荧光便往红色波段迁移，Ex/Em：482/497 nmol·L−1。若Red/Green(R/G)比值升高，则说明质子动力势水平增加。
（2）大肠杆菌胞内ATP水平测定 按照1.3.2的方法制作平台期大肠杆菌不同处理下的菌液，各加入100 µL裂解液吹打混匀，于10 000 r·min−1、4℃离心5min，取上清与检测试剂混合后使用酶标仪化学发光Luminescence（RLU）检测其荧光值，荧光值越大，则ATP含量越多。同时按照0、0.1、1、5、10 µmoL·L−1 ATP浓度梯度制备ATP标准品作标准曲线，将样品得出的荧光值代入标准曲线中得出ATP含量。
（3）大肠杆菌胞内NADH含量测定 按照1.3.2的方法制作平台期大肠杆菌不同处理下的菌液，加入200 µL预冷的增强型NAD+/NADH提取液。于12 000 r·min−1，4℃离心8 min，取上清与乙醇脱氢酶工作液混合在酶标仪450 nm处测试其吸光度，同时制备不同浓度的NADH标准品用于制备标准曲线，将样品测得的吸光度代入标准曲线后得出NAD+、NADH的含量。
1.3.3 细菌对妥布霉素的摄取试验
将培养至平台期的大肠杆菌经过不同Tob浓度（50、100、200 μg·mL−1）与D-trehalose（30 mmol·L−1）共同处理3 h后离心去上清，用PBS洗涤2遍后加入2 mg·mL−1溶菌酶充分裂解4 h，液氮冻融两次，90℃加热10 min，使细菌细胞完全裂解释放摄入的抗生素，离心得到上清作为样品备用。同时制备标准品，将未处理的菌液经溶菌酶吹打混匀后加入终浓度为0、20、40、60、80、100 μg·mL−1的Tob，于37℃下充分裂解4 h后，液氮反复冻融两次，90℃加热10 min，离心得到上清作为对照标准品。
制备含有BW25113菌株的方型培养皿，按照顺序将上清点涂到方板上，与对照标准品相比，若摄入抗生素浓度越多，则点涂的位置抑菌圈越大，细菌不生长的区域则越大。测量标准品的抑菌圈直径为横坐标，Tob浓度为纵坐标作标准曲线。代入样品的抑菌圈直径，最后计算得出样品中摄取的抗生素含量。
2. 结果与分析
2.1 D-trehalose协同Tob杀灭临床耐药大肠杆菌的效果分析
由图1可知，Tob单处理组在杀灭8株耐药大肠杆菌的效果上与未处理组相比无显著差异。而Tob+D-trehalose双处理组的杀菌效果与Tob单处理组相比显著增强。其中，与Tob单处理相比，
210215789 、210305622 、210117294 、210117528 这4株临床大肠杆菌在D-trehalose+Tob双处理下增强了4个数量级的杀菌效果，而210215749 、210829790 、210305607 、210829776 这4株增强了约3个数量级的杀菌效果。结果表明，D-trehalose能够显著增强Tob杀灭临床耐药大肠杆菌。![]()
图 1 D-trehalose协同Tob对8株临床分离大肠杆菌的杀伤效果测试注：**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；****表示P小于0.0001Figure 1. Killing effect detection of D-trehalose combined with Tob on 8 strains of clinically isolated Escherichia coli2.2 大肠杆菌胞内质子动力势变化情况
由图2A可知，未处理组其R/G比值为0.68，在加入了D-trehalose后其R/G比值增加为1.26，说明D-trehalose单处理下的大肠杆菌PMF显著高于未处理组。
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图 2 大肠杆菌胞内质子动力势变化水平检测注：A为未处理以及D-trehalose单处理的大肠杆菌质子动力势。B为Tob单处理，Tob+ D-trehalose双处理。C为Genta单处理，Genta+ D-trehalose双处理。在ACEA NovoCyte TM、FITC（绿色）和Texas Red（红色）上通过流式细胞仪分析细胞红绿荧光（R/G）的比值。Figure 2. Change level detection of intracellular proton motive force of Escherichia coli由图2B和图2C可知，Tob单处理下R/G比值为1.207，而Tob+D-trehalose双处理后R/G值为1.444。Genta单处理时R/G值为1.295，加入了D-trehalose后其R/G值为1.747。
以上结果证实，外源添加D-trehalose促进了大肠杆菌PMF的升高，从而提高了大肠杆菌对抗生素的摄取，增强了抗生素的杀菌效果。
2.3 大肠杆菌胞内ATP含量测定结果
由图3B可知，与未处理组相比，外源添加D-trehalose后大肠杆菌产生ATP的含量显著增加。而与Tob与Genta单处理组相比，D-trehalose联合抗生素的双处理组中大肠杆菌产生的ATP含量显著升高，说明外源添加D-trehalose可以显著提高细菌的新陈代谢水平，从而提高抗生素的杀菌效率。
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图 3 大肠杆菌胞内ATP含量测定结果注：A为设置0、0.1、1、5、10 µmol·L−1 ATP浓度作为ATP标准浓度对照。B为将处理组的实测发光（RLU）值代入标准曲线，得到ATP含量。NS表示组间无显著性差异；*表示P＜0.05,**表示P＜0.01Figure 3. Determination result of intracellular ATP content in Escherichia coli2.4 大肠杆菌胞内NADH含量测定结果
由图4B可知，D-trehalose处理的细菌中NAD+的浓度高于未处理组，Tob/Genta单处理组的NAD+含量低于未处理组，并且在添加了D-Trehalose后显著上升。
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图 4 大肠杆菌胞内NAD+及NADH含量测定结果注：A为在OD450条件下测得NADH的标准曲线。B为不同处理条件的样品在OD450条件测出的NAD+含量。C为不同处理条件的样品在OD450条件测出的NADH含量。D为将NAD+与NADH进行比值计算得出最后数值。Figure 4. Determination results of intracellular NAD+ and NADH contents in Escherichia coli由图4C可知，D-trehalose处理的细菌中NADH的浓度高于未处理组，Tob/Genta单处理组的NADH含量低于未处理组，同样在添加了D-trehalose后显著上升。
由图4D可知，D-trehalose处理组的NAD+/NADH比值低于未处理组，Tob/Genta+ D-trehalose双处理组NAD+/NADH含量低于Tob/Genta单处理组，说明在D-trehalose作用下大肠杆菌产生NADH的浓度显著大于NAD+，增强了细菌代谢活性，激活电子传递链，从而提高了抗生素杀菌效率。
2.5 细菌对妥布霉素的摄取
由图5A可知，D-trehalose协同Tob处理下的杀菌效果显著高于Tob单处理组。由图5B可知，在D-trehalose浓度不变的情况下，随着Tob浓度增大，Tob+D-trehalose处理后的大肠杆菌体内抗生素含量高于Tob单处理组，证明D-trehalose增加了大肠杆菌对Tob的摄取，并且效果显著。由图5C可知，较为显著的抑菌圈200 μg·mL−1 Tob处理下，抗生素进入胞内含量为20 ug·mL−1，而加入D-trehalose后Tob摄取量为40 μg·mL−1。由此可见，外源添加D-trehalose确实可以增强大肠杆菌对抗生素的摄取，导致细菌死亡。
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图 5 D-trehalose协同Tob处理下形成的抑菌圈结果注：A为平台期大肠杆菌细胞妥布霉素与D-trehalose协同处理3 h后的杀菌表型，B为定量妥布霉素摄取结果，C为妥布霉素摄取的标准曲线Figure 5. Results of inhibition zone formed by the treatment of D-trehalose combined with Tob3. 讨论
细菌耐药性正成为全球公共卫生和人类健康面临的严峻挑战，其影响波及农业、水产养殖业和畜牧业等多个关键领域。深入理解细菌对抗生素的应对机制[6−10]，对于开发有效策略以杀灭耐药菌株至关重要，而人体所需的代谢物作为抗生素佐剂在中枢代谢中发挥了重要作用。某些代谢物如葡萄糖[11]、果糖[12]、甘露醇[13]或丙酮酸[14]等，能够促进细菌糖酵解、增加NADH生成、激活电子传递链（electron transport chain，ETC）并提高细胞膜的质子动力势，从而促进氨基糖苷类抗生素如庆大霉素的摄取，增强其杀菌效果[15]。物理手段如热休克[16]以及低离子休克[17]，通过依赖PMF的变化和细胞内蛋白质的聚集，也能增强氨基糖苷类抗生素的摄取，进而杀灭细菌。这些抗生素佐剂的发现及代谢机理研究，大大增加了抗生素的作用，减少耐药性的产生，为新的抗生素的发现提供了一种替代和补充的策略。
本研究通过外源添加代谢物D-trehalose，发现其显著增加了Tob对临床分离耐药大肠杆菌的杀伤效果。此外，D-trehalose促进大肠杆菌PMF水平升高，增加ATP及NADH的产生并增强细菌代谢活性，激活电子传递链，从而提高细胞内抗生素浓度并有效杀死细菌。这些结果不仅为D-trehalose作为一种安全高效的抗生素佐剂的应用提供了科学依据，也为临床应对氨基糖苷类抗生素耐药性问题提供了新的视角。尽管如此，D-trehalose在体内的实际效果，特别是在小鼠模型中的联合作用，仍需进一步的研究来验证[18]。未来的工作将集中于评估D-trehalose在不同生物体内的效果，以及其与其他抗生素联合使用的潜力，为抵抗耐药细菌提供新思路。
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图 1 D-trehalose协同Tob对8株临床分离大肠杆菌的杀伤效果测试
注：**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；****表示P小于0.0001
Figure 1. Killing effect detection of D-trehalose combined with Tob on 8 strains of clinically isolated Escherichia coli
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图 2 大肠杆菌胞内质子动力势变化水平检测
注：A为未处理以及D-trehalose单处理的大肠杆菌质子动力势。B为Tob单处理，Tob+ D-trehalose双处理。C为Genta单处理，Genta+ D-trehalose双处理。在ACEA NovoCyte TM、FITC（绿色）和Texas Red（红色）上通过流式细胞仪分析细胞红绿荧光（R/G）的比值。
Figure 2. Change level detection of intracellular proton motive force of Escherichia coli
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图 3 大肠杆菌胞内ATP含量测定结果
注：A为设置0、0.1、1、5、10 µmol·L−1 ATP浓度作为ATP标准浓度对照。B为将处理组的实测发光（RLU）值代入标准曲线，得到ATP含量。NS表示组间无显著性差异；*表示P＜0.05,**表示P＜0.01
Figure 3. Determination result of intracellular ATP content in Escherichia coli
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图 4 大肠杆菌胞内NAD+及NADH含量测定结果
注：A为在OD450条件下测得NADH的标准曲线。B为不同处理条件的样品在OD450条件测出的NAD+含量。C为不同处理条件的样品在OD450条件测出的NADH含量。D为将NAD+与NADH进行比值计算得出最后数值。
Figure 4. Determination results of intracellular NAD+ and NADH contents in Escherichia coli
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图 5 D-trehalose协同Tob处理下形成的抑菌圈结果
注：A为平台期大肠杆菌细胞妥布霉素与D-trehalose协同处理3 h后的杀菌表型，B为定量妥布霉素摄取结果，C为妥布霉素摄取的标准曲线
Figure 5. Results of inhibition zone formed by the treatment of D-trehalose combined with Tob
表 1 8株临床耐药大肠杆菌具体信息
Table 1 Specific information of 8 clinical drug-resistant E. coli strains
抗生素 菌株 210215789 210305622 210117294 210117528 210215749 210829790 210305607 210829776 氨苄西林 S R R R S R R R 哌拉西林 S I R ND S ND R ND 氨苄西林/舒巴坦 S R R S S S I S 哌拉西林/他唑巴坦 S S S S S S S S 头孢唑林 S R R R S R R R 头孢呋辛 S R S R S R R R 头孢他啶 S R R R S S R I 头孢曲松 S R R R S R R R 头孢吡肟 S S R R S S R R 头孢替坦 S R S ND S ND S ND 头孢呋辛酯 S R R ND S V R ND 氨曲南 S R R R S S R R 亚胺培南 S S S S S S S S 美罗培南 S S S S S S S S 阿米卡星 S S S S S S S S 庆大霉素 S S S ND S ND S ND 妥布霉素 R S S S S S S S 环丙沙星 I S S R S S S R 左旋氧氟沙星 S S I R S I S I 复方新诺明 I S S R S R S S 呋喃妥因 S S ND ND ND S ND 头孢哌酮舒巴坦 S ND S S S S ND S 阿莫西林克拉维酸 S I S S S S S S 替卡西林克拉维酸 S R ND S ND S S S 粘菌素 ND ND ND S ND S ND S 多西环素 ND ND ND R ND S ND R 米诺环素 ND ND ND I ND S ND S 替加环素 ND ND ND S ND S ND S 注：“S”代表敏感，“I”代表中介，“R”代表耐受，“ND”代表没有检测。 
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